(5) Коэффициент回收а = объём элюата × массовая концентрация проантоцианидинов в элюате / (объём образца × массовая концентрация проантоцианидинов в образце) × 100%

Протокатехины различной степени чистоты находят определённое применение в таких областях, как пищевая промышленность, биологически активные добавки, фармацевтика и косметика; при этом на рынке существует разный спрос на их степень очистки. В настоящее время основными методами выделения и очистки являются экстракция растворителями, хроматография, жидкостная препаративная хроматография и др., однако наиболее широко применяется метод использования макропористых смол, который отличается простотой оборудования, удобством эксплуатации и целесообразностью для промышленного производства. В данной статье методом выделения и очистки протокатехинов из красной оболочки арахиса с использованием макропористых адсорбционных смол проводится анализ и идентификация полученного продукта с помощью HPLC-MS.
Экстракция процианидинов из красной кожуры арахиса
Мелкоизмельчите арахисовую шелуху с помощью небольшого высокоскоростного измельчителя до получения фракции, проходящей через сито с размером ячеек 40 меш; затем удалите липидные вещества, используя 10 л нефтяного эфира на 1 кг арахисовой шелухи, и проводите обезжиривание в термостатированной водяной бане при температуре 30°C в течение 5 часов, после чего отфильтруйте раствор. Остаток после фильтрации поместите в вытяжной шкаф для полного удаления нефтяного эфира и храните в осушителе до дальнейшего использования. Затем экстрагируйте оставшуюся обезжиренную арахисовую шелуху 70%-ным этаноловым раствором (объем — 10 л на 1 кг), проводя ультразвуковую экстракцию при мощности ультразвука 120 Вт и температуре 35°C в течение 10 минут; такую же процедуру повторите еще 2 раза при тех же условиях. После объединения всех полученных фильтратов произведите ротационную выпарку до сухого состояния, получив таким образом грубый экстракт протованилиновых соединений из арахисовой шелухи.
Очистка пролаурицианидинов из красной кожуры арахиса с помощью крупнопористой адсорбционной смолы
Предварительная обработка крупнопористой адсорбционной смолы
Крупнопористые адсорбционные смолы часто содержат такие компоненты, как мономеры, диспергаторы и порообразующие агенты; при использовании их необходимо удалить эти токсичные органические остатки, поэтому перед применением требуется предварительная обработка. Способы предварительной обработки: замачивание в безводном этаноле в течение 24 часов → промывка безводным этанолом до тех пор, пока выходящий раствор не перестанет быть мутным при смешении с водой в соотношении 1:5 → промывка деионизированной водой до полного отсутствия запаха спирта → погружение в 5%-ный раствор HCl на 2–4 часа → промывка деионизированной водой до нейтральной реакции выходящего раствора → погружение в 2%-ный раствор NaOH на 2–4 часа → промывка деионизированной водой до нейтральной реакции выходящего раствора; после чего смола готова к использованию.
Статические испытания на адсорбцию и десорбцию крупнопористой адсорбционной смолы
После предварительной обработки крупнопористую адсорбционную смолу отфильтровывают под вакуумом и высушивают, удаляя поверхностную влагу. Затем точно взвешивают по 1 г каждой из четырех предварительно обработанных смол и помещают их в 25-мл конические колбы с пробками. Каждую колбу доливают по 10 мл (с массовой концентрацией 5,02 мг/мл) грубого экстракта прополиса из красной кожуры арахиса, тщательно перемешивают и помещают в термостатный шейкер с воздушной баней. Скорость встряхивания составляет 120 об/мин, температура — 30°C. Через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 и 24 часа отбирают верхний прозрачный слой и определяют содержание проантоцианидинов в нем. Затем строят график зависимости адсорбции от времени, получая кинетические кривые адсорбции для каждой смолы. После этого адсорбированную насыщенную смолу фильтруют, добавляют к ней по 20 мл 95%-ного этанола и выдерживают в термостатном шейкере с воздушной баней в течение 24 часов. Полученный элюат фильтруют, после чего определяют содержание проантоцианидинов в нем. Наконец, рассчитывают степень адсорбции, количество адсорбированного вещества и степень десорбции по следующим формулам.
(1) Скорость адсорбции = (C0 - C1) / C0 × 100%
(2) Сорбционная способность = (C0 - C1) × V1 / m
(3) Скорость десорбции = C2 × V2 / (C0 - C1) × V1 × 100%
Где: C0 — массовая концентрация грубого экстракта проантоцианидинов из красной оболочки арахиса, мг/мл; C1 — массовая концентрация проантоцианидинов в супернатанте после адсорбции на смоле, мг/мл; C2 — массовая концентрация раствора для десорбции проантоцианидинов, мг/мл; V1 — объем супернатанта после адсорбции на смоле, мл; V2 — объем раствора для десорбции проантоцианидинов, мл; m — масса сухой смолы, г.

Очищение проантоцианидинов из красной кожуры арахиса с помощью крупнопористой смолы AB-8
Отмерьте обработанную крупнопористую адсорбционную смолу AB-8 и загрузите её в хроматографическую колонку. Затем пропустите через колонку грубый экстракт проантоцианидинов из красной кожуры арахиса с определённой массовой концентрацией (желательно, чтобы экстракт был прозрачным); температура в колонке должна быть комнатной. При элюции сначала промойте колонку 4 объёмными единицами дистиллированной воды, чтобы удалить более крупные по молекулярной массе примеси, такие как белки и полисахариды; затем постепенно элюируйте проантоцианидины, адсорбированные на смоле, растворами этанола разной объёмной доли, используя 4 объёмные единицы. Потоки элюата собирают порциями, затем удаляют растворитель методом ротационной испарации до высыхания, получая таким образом очищенный продукт — проантоцианидины. Далее рассчитайте чистоту и выход продукта — проантоцианидинов, используя представленные ниже формулы.
(4) Чистота = масса проантоцианидинов в очищенном веществе / масса очищенного вещества × 100%
(5) Коэффициент回收а = объём элюата × массовая концентрация проантоцианидинов в элюате / (объём образца × массовая концентрация проантоцианидинов в образце) × 100%
Определение проантоцианидинов
Построение стандартной кривой по пролептинам
Точно отмерьте 0,0500 г стандарта проантоцианидинов, растворите в метаноле и доведите объем до 25 мл, получив стандартный раствор проантоцианидинов с концентрацией 2,0 мг/мл (готовится непосредственно перед использованием). Далее точно отмерьте 0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 и 4,0 мл стандартного раствора проантоцианидинов в 10-мл коричневые мерные колбы, разбавьте метанолом до отметки — таким образом вы получите рабочие растворы с массовыми концентрациями 0, 0,10, 0,20, 0,30, 0,40, 0,60 и 0,80 мг/мл соответственно. Затем отберите по 1 мл каждого из рабочих растворов в 10-мл пробирки, добавьте в каждую по 6 мл 0,04 г/мл раствора ванилина в метаноле и 3 мл концентрированной соляной кислоты, тщательно перемешайте и выдержите в термостатированной водяной бане при температуре (30 ± 1)°C в течение 20 минут. После этого извлеките пробирки и измерьте их оптическую плотность при длине волны 500 нм, построив тем самым стандартную кривую. Уравнение регрессии имеет вид: Y = 1,3306X + 0,0664, R² = 0,9966.
Определение проантоцианидинов из красной кожуры арахиса
Возьмите 1 мл грубого экстракта пролептина из красной кожуры арахиса, разбавленного в определённое количество раз, и добавьте к нему поочередно 6 мл раствора ванилина в метаноле с концентрацией 0,04 г/мл и 3 мл концентрированной соляной кислоты. Тщательно перемешайте, затем выдерживайте в термостатированной водяной бане при температуре (30 ± 1)°C в течение 20 минут. После этого достаньте пробирки и измерьте их оптическую плотность при длине волны 500 нм. Массовую концентрацию пролептина в образце можно рассчитать на основе уравнения регрессии стандартной кривой.
1. 2,4 HPLC-MS определение прокатехинов из красной оболочки арахиса
По 10 мг элюированных фракций растворяют в 10 мл хроматографически чистого метанола, затем фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм и проводят анализ методом ВЭЖХ-МС.
Хроматографические условия: хроматографическая колонка CSH (2,1 мм × 100 мм, размер частиц 1,9 мкм); подвижная фаза A — ацетонитрил, подвижная фаза B — водный раствор 0,1%-ной муравьиной кислоты; температура колонки — 45°C; объем вводимой пробы — 1 мкл; режим элюции подвижных фаз: 0–0,1 мин — 5% A; 0,1–30 мин — 5% → 20% A; 30–32 мин — 20% → 80% A; 32–32,5 мин — 80% → 5% A; 32,5–35 мин — 5% A.
Условия масс-спектрометрии: источник ионизации ESI, режим отрицательных ионов; напряжение на капилляре 3,0 кВ, напряжение на конусном отверстии 40,0 В; температура источника ионов 100°C, температура десольвентации 400°C; скорость потока газа через конусное отверстие 50,0 л/ч, скорость потока десольвентации 700,0 л/ч; напряжение столкновения 6 В; диапазон сканирования относительной молекулярной массы (m/z) от 50 до 2000.
2. Результаты и обсуждение
2.14 вида крупнопористых адсорбционных смол: статическая адсорбция и десорбция прокампферолов из красной оболочки арахиса
Крупнопористые адсорбционные смолы представляют собой разделительную среду, сочетающую в себе принципы адсорбции и молекулярного сита; их адсорбционная способность связана с силами Ван-дер-Ваальса и водородными связями между адсорбентом и адсорбатом. В данном эксперименте использовались следующие крупнопористые адсорбционные смолы: полярная смола (NKA-9), умеренно полярная смола (HPD750), слабополярная смола (AB-8) и неполярная смола (D101).
Смолы крупнопористой структуры NKA-9 и AB-8 демонстрируют высокую степень адсорбции проантоцианидинов, тогда как смола D101 крупнопористой структуры обладает более низкой адсорбционной способностью по сравнению с другими подобными материалами. Молекулы проантоцианидинов содержат несколько фенольных гидроксильных групп, что позволяет им образовывать водородные связи, придавая молекулам определённую гидрофильность и полярность; именно поэтому они легко адсорбируются полярными, умеренно полярными и слабополярными смолами. Кроме того, адсорбционная способность крупнопористых смол зависит также от их пористой структуры и удельной поверхности. У смолы HPD750 большая удельная поверхность и меньший размер пор, что затрудняет проникновение молекул проантоцианидинов внутрь смолы через её поры и, соответственно, снижает эффективность адсорбции. В свою очередь, поверхность смолы NKA-9 обладает высокой полярностью, что приводит к интенсивному взаимодействию с молекулами проантоцианидинов и может препятствовать их десорбции. Статические кинетические кривые крупнопористых адсорбентов обычно делятся на два типа: первый — это тип быстрого равновесия, характеризующийся резким увеличением количества адсорбированного вещества в начальной стадии процесса и быстрым достижением адсорбционного равновесия; второй тип — медленное равновесие, при котором начальное количество адсорбата невелико, скорость нарастания адсорбции низка, а время достижения равновесия значительно больше. Адсорбция проантоцианидинов смолами AB-8, NKA-9 и D101 относится к типу быстрого равновесия, в то время как для смолы HPD750 характерно медленное равновесие. Таким образом, учитывая одновременно объём адсорбции, степень десорбции и особенности статической адсорбционной кинетики, можно сделать вывод, что смола AB-8 обладает наибольшей адсорбционной ёмкостью, лёгкостью десорбции и способностью быстро достигать адсорбционного равновесия. Именно поэтому смола AB-8 крупнопористой структуры выбрана в качестве адсорбента для выделения и очистки проантоцианидинов из красной кожуры арахиса.
Влияние скорости подачи образца на адсорбцию проантоцианидинов на крупнопористой адсорбционной смоле AB-8
При низкой скорости подачи образца время контакта растворённого вещества в пробе с смолой увеличивается, что приводит к более полному адсорбированию; при слишком высокой скорости молекулы растворённого вещества не успевают диффундировать на внутреннюю поверхность смолы и адсорбироваться, из-за чего адсорбция становится недостаточной, а также теряется часть образца. Поэтому в данном эксперименте исследуется влияние скорости подачи образца на адсорбцию проантоцианидинов на крупнопористой адсорбционной смоле AB-8.
При скоростях подачи образца 0,25 мл/мин и 0,5 мл/мин адсорбционная способность крупнопористой смолы по отношению к проантоцианидинам была достаточно высокой, при этом время утечки составляло 250 мин и 180 мин соответственно. При скоростях подачи 0,75 мл/мин и 1,0 мл/мин утечка происходила раньше, а процесс адсорбции оставался неполным. С учётом реальных производственных условий наиболее подходящей скоростью подачи образца следует считать 0,5 мл/мин.
Влияние скорости элюирования на эффективность элюирования проантоцианидинов
Чтобы обеспечить достаточное время контакта элюента с растворённым веществом, адсорбированным на макропористой абсорбирующей смоле AB-8, и эффективно провести десорбцию, необходимо осуществлять элюирование элюентом с подходящей скоростью. Поэтому было изучено влияние скорости элюирования на эффективность выделения проантоцианидинов:
При скоростях элюирования 0,5 мл/мин и 1,0 мл/мин эффект элюирования был практически одинаковым, тогда как при скорости элюирования свыше 2,0 мл/мин эффективность заметно ухудшалась, а степень чистоты проантоцианидинов также тенденциально снижалась. Поэтому было выбрано значение скорости элюирования 1,0 мл/мин, при котором степень десорбции проантоцианидинов составила 89,31%, а их чистота — 98,7%.
Эффект элюирования проантоцианидинов различными объемными фракциями этанола
При разделении и очистке с использованием крупнопористой адсорбционной смолы обычно применяется этаноловый раствор; полярность этаноловых растворов различается в зависимости от их объёмной доли, что также влияет на способность этих растворов элюировать процианидины. Поэтому в данном эксперименте изучалось влияние этаноловых растворов разной объёмной доли на эффективность элюирования процианидинов.
Концентрация этанола значительно влияет на кривую элюирования протовицианидинов из красной кожуры арахиса: так, пик кривой элюирования при 40%-ном растворе этанола оказался самым высоким, и при сборе в диапазоне от 0,8 до 2,5 объёмных единиц удалось получить относительно высокую концентрацию протовицианидинов. Раствор этанола с концентрацией 20% показал лучший эффект элюирования протовицианидинов, проявляя чёткий пик с небольшим хвостом. Растворы же с концентрацией 10% и 95% продемонстрировали плохую способность к элюированию протовицианидинов, и на их кривых элюирования не наблюдалось выраженного пика. Таким образом, путём сбора элюатов в различных диапазонах можно получать протовицианидины разной степени очистки.
Влияние способа элюирования или сбора на эффект десорбции проантоцианидинов
Протоантоцианы представляют собой смесь катехинов или эпикатехинов с различной степенью полимеризации и содержат большое количество фенольных гидроксильных групп; в процессе адсорбции на смоле крайне вероятно возникновение адсорбции через водородные связи, из-за чего процессы адсорбции и десорбции, а также их скорости для протоантоцианов с разной степенью полимеризации неизбежно будут различаться. Поэтому при градиентной элюции с высокой вероятностью можно получить протоантоцианы с разной степенью полимеризации или с различной степенью чистоты. Приведем данные о десорбционной эффективности четырёх образцов протоантоцианов, собранных при элюировании этанолом с различными объёмными фракциями:
Наибольшую чистоту пролаютецина удалось получить при элюировании 20%-ным этаноловым раствором; при использовании 40%-ного раствора этанола степень его восстановления оказалась******. Поэтому в качестве элюентов для получения пролаютецина выбраны 20%-ный и 40%-ный этанол.
Также следует собрать элюаты с 20%-го и 40%-го этанола соответственно:
Сухой остаток, полученный методом элюирования с использованием 20%-ного этанола, уменьшался от большего к меньшему, тогда как чистота возрастала от низкой до высокой и затем снова снижалась; максимальная чистота проантоцианидинов, составляющая 23,4% от общей сухой массы, была достигнута в элюате, собранном при объеме примерно 2–3,5 BV. Сухой остаток, полученный методом элюирования с использованием 40%-ного этанола, уменьшался от большего к меньшему, а чистота, наоборот, повышалась от высокой до низкой; максимальная чистота проантоцианидинов, составляющая 84,2% от общей сухой массы, была достигнута в элюате, собранном при объеме примерно 0–2 BV.
При промышленном производстве можно выбирать различные способы элюирования или сбора в зависимости от требований к продукту. При элюировании 20%-ным этанолом сбор элюата в объёме 2–3,5 BV позволяет получить проантоцианидины с чистотой более 98%, а при сборе элюата в объёме 0–4 BV — проантоцианидины с чистотой выше 95%. При элюировании 40%-ным этанолом сбор элюата в объёме 0–2 BV даёт проантоцианидины с чистотой от 85% до 90%, а сбор элюата в объёме 0–4 BV обеспечивает получение проантоцианидинов с чистотой около 80%.
Результаты анализа экстракта пролептидинов из красной кожуры арахиса методом ЖХВД-МС
Чистые вещества, выделенные с помощью крупнопористой адсорбционной смолы AB-8, представляют собой олигомерные проантоцианидины. Основными компонентами очищенного продукта, полученного с использованием 20%-ного этанола, являются димер и тример проантоцианидинов типа A, тогда как в очищенном продукте, полученном с 40%-ным этанолом, преобладают димер и тетрамер проантоцианидинов типа A. Исследования показали, что только олигомеры с низкой молекулярной массой (степень полимеризации ≤3) полностью усваиваются желудочно-кишечным трактом. Таким образом, полученные в ходе эксперимента проантоцианидины из красной кожуры арахиса, обладая небольшой молекулярной массой, легко всасываются организмом и способны в полной мере проявлять свои физиологические функции в человеческом теле.
3. Выводы
Исследована технология получения и очистки пролепоканинов из красной кожуры арахиса с различной степенью чистоты с использованием макропористой адсорбционной смолы AB-8. Условия разделения и очистки следующие: скорость подачи образца — 0,5 мл/мин, скорость элюирования — 1,0 мл/мин, элюент — 20%-й и 40%-й этаноловый раствор. После десорбции получены два продукта: очищенный препарат в 20%-м этаноле и очищенный препарат в 40%-м этаноле. Препарат, очищенный в 20%-м этаноле, обладает самой высокой чистотой — до 98,7%, однако его выход относительно низкий, составляющий 29,41%. В то же время препарат, очищенный в 40%-м этаноле, имеет чистоту 86,2% и более высокий выход — 50,31%. Благодаря возможности получения пролепоканинов разной степени чистоты при помощи различных способов сбора, в промышленном производстве можно выбирать оптимальный режим элюирования или метод сбора в зависимости от требований к конечному продукту.
Как показал анализ методом ВЭЖХ-МС, очищенные вещества, выделенные с помощью макропористой смолы AB-8, представляют собой олигомерные пролепсины. Основными компонентами очищенного продукта, полученного с использованием 20%-ного этанола, являются димер и тример пролепсинов типа A, тогда как в очищенном продукте, полученном с использованием 40%-ного этанола, преобладают димер и тетрамер пролепсинов типа A.